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【【摘要】】 目的：研究不同浓度蛋白酶体抑制剂MG132对人肺腺癌A549细胞凋亡的作用，并且观察对细胞中Bcl-2和Bad两种凋亡相关蛋白表达的影响。方法：体外培养A549细胞分别暴露于0、5、10、20、40 μmol/L的MG132，24 h后MTT法测定细胞存活率，流式细胞术（FCW）检测细胞的凋亡率，Western Blot方法测定A549细胞中Bcl-2和Bad两种蛋白的表达情况。结果：MTT法和流式细胞术检测结果显示，A549细胞的存活率和凋亡率与MG132呈浓度依赖性关系，MG132浓度越高细胞存活率越低，并且凋亡率越高。Western Blot方法测定结果显示A549细胞中Bcl-2的表达随着MG132浓度增高而逐渐减少，而Bad的表达雅明显变化。结论：MG132可以诱导人肺腺癌A549细胞的凋亡，实现该作用的可能机制部分是通过降低Bcl-2蛋白的表达，而Bad在这一过程中似乎没有表现出明显的作用。 [关键词] 肺腺癌；蛋白酶体抑制剂；A549细胞；Bcl-2；Bad [中图分类号] R134.2；R130.54 [文献标识码] A [文章编号] 1 13-1210（2011）12（a）-032-03 The effect and mechanism on the apoptosis of adenocarcinoma of lung A549 cell treated with MG132 ZHU Yi, GONG Li, NIU Hongyan Department of Chest Aurgery, the Second People's Hospital of Huai'an City Affiliated of Xuzhou Medical College, Jiangsu Province, Huai'an 223002, China [Abstract] Objective: To study the apoptosis of adenocarcinoma of lung A549 cell treated with different concentrations of proteasomes inhibitor MG132, and to observe the expression of Bcl-2 and Bad in A549 cells. Methods: In vitro, A549 cells were exposed to 0, 5, 10, 20, 40 μmol/L of MG132. 24 hours later, the survival rate of A549 cells was detected with MTT chromatometry, flow cytometry detected the apoptosis rate of A549 cells, and the expression of Bcl-2 and Bad in A549 cells was measured with Western Blot. Results: MG132 caused the apoptosis of A549 cells in a concentration-dependent manner, the survival rate of cells was gradually decreased while the apoptosis rate of cells was increased after 24 hours exposure to MG132. Meanwhile, the expression of Bcl-2 was decreased, and the Bad expression was unchanged in A549 cells. Conclusion: MG132 could induce A549 cells apoptosis partly through depressing the expression of Bcl-2, but not promoting Bad expression. [Key words] Adenocarcinoma of lung; Proteasomes inhibitor; A549 cell; Bcl-2; Bad 近几十年来，肺癌的发病率和死亡率不断升高。在1998~2002年，肺癌的发病率和死亡率在我国大多数地区居恶性肿瘤的首位[1]；而在2002年肺癌的新病例和死亡人数在全世界也居恶性肿瘤首位[2]。肺癌的病理分型出现腺癌比例增加的趋势。在生物体内蛋白质进行选择性降解的重要途径之一是泛素-蛋白酶体通路（ubi uitin proteasome pathway，简称UPP 通路），它在调节细胞凋亡过程中的作用非常重要[3-4]，在研究UPP在细胞凋亡中的作用时，蛋白酶体抑制剂（MG132）的应用为我们提供了有力的手段。有研究表明，蛋白酶体抑制剂能够诱导多种人肿瘤细胞的凋亡是通过阻断泛素化通路而实现，但其具体作用机制到目前仍未被阐明[5- ]。该研究应用体外培养的人肺腺癌细胞株A549，并且给予不同浓度的MG132处理，观察其对A549细胞凋亡率的影响，以及细胞内Bcl-2和Bad蛋白表达水平的变化。探讨MG132调控A549细胞凋亡的可能机制，为进一步研究MG132诱导A549凋亡的机制和其他类型肺癌以及其他肿瘤的作用提供参考。 1 材料与方法 1.1 A549细胞和试剂 人肺腺癌细胞株A549购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所。新生牛血清（NBS，杭州四季青生物工程材料研究所）；RPMI-1 40培养基（Gibco公司）；AnnexinV-FITC/PI凋亡试剂盒（上海博蕴生物试剂有限公司）；MG132、一抗Bcl-2和Bad、MTT（Sigma公司）。 1.2 细胞培养及处理 将A549细胞常规复苏后，以RPMI-1 40培养液加10%NBS培养，放入31℃、5%CO2的培养箱内培养，细胞传2~3代后按照需要接种于不同培养板中，当细胞融合密度约10%时，换雅血清的RPMI-1 40培养液培养，MG132在给药前应用RPMI-1 40培养液现配。并且进一步稀释使其在培养液中的终浓度为：0、5、10、20、40 μmol/L，并设空白对照组（不做任何处理）。培养24 h，检测相关指标。 1.3 MTT比色法检测细胞存活率 细胞按照需要接种于9 孔板，处理方法同“1.2”所述，将培养24 h后的每组细胞，每孔中加入MTT 20 μl（PBS配制、5 g/L）。4 h后终止培养，吸弃所有液体，再加入二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide， DMSO）200 μl充分溶解，静置于31℃条件下30 min。用酶标仪测定510 nm光密度（OD）值，计算细胞存活率（即每组OD值/正常对照组OD值×100%＝该组的细胞存活率）。 1.4 蛋白免疫印迹（Western Blot） 将传代后细胞接种于培养瓶内，处理同方法“1.2”所述。培养24 h后收集细胞，应用胞浆蛋白抽提试剂盒提取蛋白，测蛋白后分装，保存于-80℃冰箱中备用。将等量蛋白以10%聚丙烯凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，半干转法至NC膜上，随后经5%脱脂奶粉封闭，室温下1 h，加入稀释的一抗Bcl-2（1∶300）和Bad（1∶300），4℃条件下过夜。第2日晨复温30 min，常规方法洗膜，NBT/BCIP显色，双蒸水洗膜终止反应。应用图像处理仪（Gene Company）扫描结果，Image J软件进行半定量分析。 1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡率 细胞传代后接种于 孔板，处理方法同“1.2”所述。培养24 h，吸尽培养基，用胰蛋白酶（0.25%）消化细胞后收集，磷酸盐缓冲液（PBS）液洗2次，每组细胞收集为1管，每管加入凋亡试剂盒中的结合缓冲液将细胞重悬，随后将细胞转移到试管中。每管再分别加入10 μl的PI和5 μl的Annexin V-FITC。避光，室温放置5 min，流式细胞仪检测细胞的凋亡率。 1. 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，Sigma Plot 2000作图。计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用最小显著差（LSD-t）法，以P |
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发表于 2020-7-21 11:37:39
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