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摘要：将从深海硅藻中克隆的与氮具有高度亲和性的硝酸盐转运蛋白基因ＮＡＴ３通过农杆菌介导的遗传转化方法，转入水稻品种中花１１，在含３０ ｍｇ／Ｌ Bａｓｔａ的选择培养基上筛选，获得４５６棵抗性植株，对ＮＡＴ３目标基因检测，获得３１３棵阳性植株，初步证明目标基因已整合到中花１１基因组中。
【关键词】：转基因水稻；硝酸盐转运蛋白；氮高效利用
中图分类号：Ｓ５１１；Ｑ７８ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０11）24－5241-03
Transgenic High N Use Efficiency Rice Obtained by Agrobacterium tumefaciens
ＺＨＡ Ｚｈｏｎｇ－ｐｉｎｇ，ＷＡＮ Ｂｉｎｇ－ｌｉａｎｇ，ＹＩＮ Ｄｅ－ｓｕｏ，ＤＵ Ｘｕｅ－ｓｈｕ，ＱＩ Ｈｕａ－ｘｉｏｎｇ
（Ｆｏｏｄ Ｃｒｏｐｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｈｕｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗｕｈａｎ ４３００６４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： ＮＡＴ３ ｇｅｎｅ ｃｏｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｎｉｔｒａｔｅ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ ｃｌｏｎｅｄ ｆｒｏｍ Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ ｗａｓ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｉｎｔｏ ｒｉｃｅ ‘ｚｈｏｎｇｈｕａ １１’ ｖｉａ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ． ４５６ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｒｉｃｅ ｐｌａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ ３０ ｍｇ／Ｌ ｂａｓｔａ． ３１３ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｔｉｃ ｐｌａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｇａｉｎｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｔ ＮＡＴ３ ｇｅｎｅ． Ｉｔ ｗａｓ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｔｈａｔ ＮＡＴ３ ｇｅｎｅ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ ‘ｚｈｏｎｇｈｕａ １１’．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： transgenic ｒｉｃｅ； ｎｉｔｒａｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ； ｈｉｇｈ Ｎ ｕｓｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ
植物的生长需要合适的氮量，氮是限制植物生长的重要因素［１］。硝酸盐（ＮＯ３－）是植物主要氮源之一，硝酸盐供应量的不足经常成为限制作物生长的因素［２－４］。但过量硝酸盐如果没有被植物吸收，极易通过淋失、渗透等途径转移到水环境中，造成水体硝酸盐污染的潜在危险，对生态环境和人体健康产生极为不利的影响［５］。氮肥施用量对晚稻产量和氮肥利用效率有影响，采用氮素运筹可影响免耕移植水稻产量及氮素利用率［ ，1］。因此，提高氮肥的利用效率，对于促进氮肥的高效利用和减轻环境污染具有重要的意义。水稻是最早通过基因工程手段进行品种改良的作物之一，我国的转基因生物新品种培育重大专项也已实施，但提高水稻氮素利用率，培育氮高效利用的转基因水稻研究方面的研究不多［8］，因此迫切需要利用新的基因工程策略，培育氮高效利用的转基因水稻新种质。
该研究通过农杆菌介导的遗传转化方法，将从深海硅藻中克隆的与氮具有高度亲和性的硝酸盐转运蛋白基因ＮＡＴ３导入中花１１中，旨在培育氮肥高效利用的转基因水稻，减少氮肥施用量，节约水稻生产成本，从而降低环境污染，促进农业高效节能、可持续发展。
１ 材料与方法
１．１ 材料
用于研究的水稻材料为中花１１，植物表达载体由中国农业科学院生物技术所刘昱辉博士惠赠，根癌农杆菌菌株为ＥＨＡ１０５。
１．２ 方法
1.2.1 水稻胚性愈伤组织的获得 将成熟种子剥壳后放在５０或１００ ｍＬ三角瓶中进行常规消毒，接种于诱导培养基中，每皿约３５～４０粒，封口膜封好后于２８ ℃暗培养。
１．2.2 农杆菌介导的遗传转化 农杆菌在ＬＡ培养基上２８ ℃培养2 d后，用药勺刮取少量菌斑悬浮于含有１００ μｍｏｌ／Ｌ的乙酰丁香酮的ＬＢ培养基，调整菌液浓度至ＯＤ６００nm＝０．６左右。将经过预培养的水稻成熟胚诱导的胚性愈伤组织置于农杆菌悬浮液中，略微摇动后静置５ ｍｉｎ，然后将愈伤组织置于培养皿中无菌滤纸上，在超净工作台中吹干。最后将愈伤组织转入添加有１００ μｍｏｌ／Ｌ的乙酰丁香酮的共培养基上，１８ ℃暗培养３ ｄ。
１．2.3 抗性愈伤组织的筛选 待愈伤组织共培养２～３ ｄ，取出愈伤组织，用无菌水冲洗３～５次，每次摇动数次，直至水中不见丝状菌体。然后用含２５０ ｍｇ／Ｌ羧苄青霉素的无菌水再清洗一遍，置于无菌滤纸上吹干后，转移至选择培养基（添加２５０ ｍｇ／Ｌ羧苄青霉素以及３０ ｍｇ／Ｌ Bａｓｔａ）筛选抗性愈伤组织。每两周将愈伤组织转移至新选择培养基上，约需３次继代培养获得抗性愈伤组织。
１．2.4 抗性植株的获得 将抗性愈伤组织转移到分化培养基上进行分化培育，每一瓶中可放置３～４块不同克隆的愈伤组织。１周后愈伤组织开始转绿，３周后幼苗长到５ ｃｍ时，可进行生根培养。
１．2.5 转基因植株的ＰＣＲ检测 ＣＴＡＢ法提取水稻总ＤＮＡ。ＰＣＲ扩增ＮＡＴ３基因片段的引物序列为ＮＡＴＦ：５′-ＧＧＴＣＣＴＣＴＴＡＴＧＧＡＡＴＣＧＴＣ-３′，ＮＡＴＲ：５′-ＧＡＣＡＴＣＴＴＧＡＧＴＣＴＴＣＴＣＧＧ-３′。扩增目标片段大小为２９６ｂｐ，ＰＣＲ反应条件为：９４ ℃、５ ｍｉｎ；９４ ℃、３０ ｓ，５８ ℃、３０ ｓ，７２ ℃、１ ｍｉｎ，３５个循环；７２ ℃、１０ ｍｉｎ，４ ℃保存。以表达载体质粒、中花１１基因组ＤＮＡ分别作为阳性及阴性对照。
２ 结果与分析
２．１ 抗性植株的获得
中花１１成熟种子在诱导培养基上培养１周，即可看到盾片处有愈伤组织形成，继续在原培养基上培养１个月，即可获得颜色鲜黄、质地紧实的颗粒状胚性愈伤组织（图１ａ），诱导率达９７．０％。愈伤组织与农杆菌共培养２～３ ｄ后，经脱菌进行选择培养。约继代培养３次后，获得抗性愈伤组织（图１ｂ），抗性愈伤组织获得率为７３．４％。抗性愈伤组织经分化培养３～４周可获得抗性植株（图１ｃ），分化率为２８.0％。抗性植株在１／２ＭＳ生根培养基上生根率达到９４．５％，共获得抗性植株45 棵。
２．２ 转基因植株的ＰＣＲ检测结果
根据ＮＡＴ３基因的序列设计一对特异性引物，对获得的所有抗性植株进行ＮＡＴ３阳性检测。有３１３棵检测到２９６ ｂｐ目的基因片段，阳性率为６８．６％，部分植株检测结果见图２。
３ 讨论
１）中国的水稻氮肥施用量占全球水稻施用量的３７％，氮肥利用率远远低于全球的平均水平；中国水稻种植施用的氮肥占氮肥总使用量的２４％［9］。过量施用氮肥导致环境污染，降低了农民的收入。研究将从海藻中克隆的硝酸盐转运蛋白ＮＡＴ３基因，通过农杆菌介导的遗传转化方法转化水稻品种中花１１中，对获得的再生植株ＮＡＴ３基因ＰＣＲ检测表明目标基因ＮＡＴ３已整合到中花１１基因组中。
２）为了明确ＮＡＴ３基因在转基因水稻中能否提高氮素利用率，对部分目标基因阳性单株进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，以期检测目标基因单拷贝整合的转基因植株，目前该工作正在进行。并将进一步利用ＲＴ－ＰＣＲ对单拷贝转基因株系中ＮＡＴ３基因的表达进行分析，筛选出ＮＡＴ３基因不同表达水平的转基因株系，并对不同株系的节氮效果进行试验，从而为ＮＡＴ３转基因水稻的氮素利用效率做出科学评价，为进一步培育氮高效利用新品种奠定基础。
参考文献：
［１］ ＭＡＴＴＳＯＮ Ｗ Ｊ，ＨＡＡＣＫ Ｒ Ａ，ＬＡＷＲＥＮＣＥ Ｒ Ｘ，ｅｔ ａｌ． Ｃｏｎｓｉｄｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ ｅｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｒｕｃｅ ｂｕｄｗｏｒｍ ｉｎ ｉｔｓ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ［Ｊ］． Ｆｏｒｅｓｔ Ｅｃｏｌｏｇｙ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，１９９１，３９：１８３－２１０．
［２］ ＣＲＡＷＦＯＲＤ Ｎ Ｍ，ＧＬＡＳＳ Ａ Ｄ Ｍ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｎｉｔｒａｔｅ ｕｐｔａｋｅ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］． Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ，１９９８，３（１０）：３８５－３８９．
［３］ ＤＡＮＩＥＬ Ｖ Ｆ，ＦＩＬＬＥＵＴ Ｓ，ＣＡＢＥＣＨＥ Ｍ． Ｎｉｔｒａｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ：ａ ｋｅｙ ｓｔｅｐ ｉｎ ｎｉｔｒａｔｅ ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ，１９９８，１（３）：２３５－２３９．
［４］ ＷＩＬＬＩＡＭＳ Ｌ Ｅ，ＭＩＬＬＥＲ Ａ Ｊ． Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｕｐｔａｋｅ ａｎｄ ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ ｏｆ ｎｉｔｒｏｇｅｎｏｕｓ ｓｏｌｕｔｅｓ［Ｊ］． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ ＰyｓｉｏＩ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏ，２００1，５２（６）：６５９－６８８．
［５］ ＶＥＲＭＥＥＲ Ｉ Ｔ Ｍ，ＰＡＣＨＥＮ Ｄ Ｍ Ａ Ａ，ＤＡＬＬＩＮＧＡ Ｊ Ｗ，ｅｔ ａｌ． Ｎｉｔｒｏｓｍｎｉｎｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｉｎｔａｋｅ ｏｆ ｎｉｔｒａｔｅ ａｔ ｔｈｅ ＡＤＩ ｌｅｖｅＩ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｎ ａｍｉｎｅ－ｒｉｃｈ ｄｉｅｔ［Ｊ］．Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ，１９９８，１０６（８）：４５９－４６３．
［ ］ 李向辉，鲁艳红，廖育林，等． 氮肥施用量对晚稻产量和氮肥利用效率的影响［Ｊ］．湖南农业科学，２０１０，４９（８）：５２－５４．
［1］ 姜新有，周江明．氮素运筹对免耕移植水稻产量及氮素利用率的影响［Ｊ］． 江西农业学报，２０１１，２３（９）：１０４－１０８．
［8］ 刘 丽，于志晶，张文娟，等． 转基因抗虫水稻研究进展［Ｊ］．安徽农业科学，２０１１，３９（９）：５１０９－５１１０，５１４７．
［9］ 彭少兵，黄见良，钟旭华，等． 提高中国稻田氮肥利用率的研究策略［Ｊ］．中国农业科学，２００２，３５（９）：１０９５－１１０３．
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发表于 2020-6-3 08:35:25
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