力学刺激调控哺乳动物细胞有丝分裂方向的机制及其在管腔形态发生中的作用

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雅宝题库解析：
生物体在力学环境中发生、发育、演化并与之相适应。现在已知细胞作为生物体的基本单位，其形态结构和功能都广泛地受到力学刺激的影响。哺乳动物细胞的有丝分裂方向作为细胞分化、器官形成、疾病发生等过程中的一个关键步骤，其与力学环境的关系尚不明确。本文重点关注力学/物理环境对哺乳动物细胞有丝分裂方向的影响及其机制，从两个题目入手，分别论述周期性单轴拉伸力学刺激影响哺乳动物细胞有丝分裂方向以及应力纤维排布的机制；以及细胞外基质蛋白（Extracellular Matrix Protein）空间分布影响细胞有丝分裂方向，诱导管腔样结构发生的作用机制。一、周期性单轴拉伸刺激影响哺乳动物细胞有丝分裂方向以及应力纤维排布的机制    以小鼠成纤维细胞（Murine 3T3 fibroblasts）为模型，本文研究了周期性单轴拉伸刺激下细胞有丝分裂方向与应力纤维排布的规律。研究表明周期性单轴拉伸刺激可以诱导细胞有丝分裂方向与应力纤维垂直于外载方向排布；而阻断应力纤维的两种基本成分（微丝和肌球蛋白Ⅱ）可导致应力纤维和有丝分裂方向重排；特别是在低浓度的肌球蛋白Ⅱ抑制剂（ML7和Blebbistatin）的作用下，细胞有丝分裂与应力纤维均平行于外载方向。上述所有实验条件下，应力纤维排布和有丝分裂方向均具有高度相关性。撤掉外载，在应力纤维排布未改变的情况下，细胞有丝分裂方向仍与应力纤维排布方向保持一致。说明外载并不直接决定有丝分裂方向。考虑到应力纤维的排布先于有丝分裂定向发生，因此上述结果提示单轴拉伸力学刺激通过诱导应力纤维的排布影响有丝分裂方向的确定。    注意到低浓度的肌球蛋白Ⅱ抑制剂可导致应力纤维平行于周期性单向外载方向排布这一有趣的现象，本文引入分子生物学实验手段，继而对周期性单轴拉伸诱导细胞应力纤维垂直于外载排布的机制进行了探讨。采用Y27632、ML7和Blebbistatin分别特异性地抑制Rho-kinase活性、肌球蛋白轻链激酶（Myosin Light Chain Kinase，MLCK）活性以及肌球蛋白轻链（Myosin Light Chain, MLC）的磷酸化，直接或间接地抑制了MLC的磷酸化水平。根据以往文献报道，细胞应力纤维的内应力（Actomyosin contractility）由MLC磷酸化驱动，MLC的磷酸化水平可以表征细胞应力纤维内应力的大小，因此上述抑制剂均能对细胞内应力产生抑制作用。实验表明，随着抑制剂（ML7或Blebbistatin）剂量增加，MLC磷酸化水平下降，周期性单轴拉伸刺激下的细胞微丝骨架排布呈现垂直于外载→随机分布→平行于外载→随机分布的变化趋势。其次，采用Calyculin A刺激细胞的内应力之后，MLC的磷酸化水平升高，并且应力纤维垂直于外载的趋势增强。第三，对上述所有实验组别的统计学分析表明，周期性单轴拉伸刺激下，应力纤维与外载方向之间的平均夹角与MLC磷酸化水平之间存在着单调增加的线性关系，而且这种关系不受外加的影响因素（药物）的影响。    上述结果表明，周期性单轴拉伸刺激下，细胞的内应力水平是调控应力纤维排布方向的重要因素，而应力纤维的排布最终决定了细胞有丝分裂方向的确定。二、表皮形态生成素（Epimorphin，EPM）在诱导肝干/祖细胞（WB-F344）形成胆管结构过程中的作用及其机制的研究    管腔形态的发生机制是发育生物学、组织工程和再生医学中的关键题目。肝脏具有强大的再生能力，管腔形态发生是其再生的关键步骤。本文以大鼠WB-F344细胞为模型，研究了EPM诱导肝干/祖细胞向胆管分化，形成胆管结构的作用机理。不可溶EPM在体外可以诱导肝干/祖细胞WB-F344向胆管世系分化，形成管腔样结构，并促使WB-F344细胞形成粘着斑，诱导细胞应力纤维成平行的束装排列；而单纯在培养基中加入可溶EPM则无此作用。上述现象以及以往文献报道，提示EPM的空间分布是管腔样结构发生的关键。引入微/纳米制造技术（Micro-pattern），本文设计了一个细胞-EPM相互作用的模型体系，实验表明不可溶的EPM可以诱导WB-F344细胞有丝分裂方向的确定。采用抗EPM抗体、β1整合素中和性抗体以及Latrunculin A处理细胞后，上述模型体系中的细胞有丝分裂方向呈随机分布，说明细胞有丝分裂定向依赖于EPM、β1整合素介导的粘附以及应力纤维。针对WB-F344细胞的单轴拉伸实验进一步表明细胞的应力纤维排布方向在有丝分裂的定向过程中起重要作用。在不可溶EPM诱导WB细胞形成管腔样形态的实验中，阻断细胞微丝骨架的组装或用β1整合素中和性抗体处理细胞均能阻断EPM诱导的管腔形态发生。    综合上述实验现象，本文提出EPM空间分布诱导WB-F344细胞形成管腔样结构的机制的假说：EPM通过调控粘着斑和应力纤维的合成与排布，进而影响WB-F344细胞的有丝分裂方向的确定，并最终诱导其形成具有胆管上皮细胞标志的管腔样结构。